食品微生物能力驗證--菌落總數(shù)檢測操作過程分享

一、菌落總數(shù)小常識

菌落總數(shù)的測定方法，看似非常簡單，但由于食品種類繁多，食品中可能存在的微生物菌群較多，要在同等條件下把所有的細菌培養(yǎng)出來，反應(yīng)樣品的真實情況，實屬不易。

一、能力實驗的目的

開展能力驗證試驗是檢驗實驗室檢測能力和提高檢測水平的重要手段。利用實驗室間的比對，對實驗室的校準或檢驗工作進行判定。

關(guān)鍵是，能力驗證是考察實驗室檢驗?zāi)芰Φ耐獠抠|(zhì)量活動，組織方提供試驗樣本，在菌落總數(shù)項目上，一般會考慮增加上述難度。

二、測定標準

食品國家標準：GB 4789.2-2022 《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》

三、操作過程

（一）前期做好充足的準備工作：

根據(jù)國家標準，提前準備好要用的平板計數(shù)瓊脂、平皿、試管、稀釋液（生理鹽水）、三角燒瓶等。

（二）樣品接受：

收到樣品后，確認樣品包裝是否完好，并將其保存在2~8℃冰箱中，然后在能力驗證平臺進行確認。

（三）樣品處理：

按照作業(yè)指導(dǎo)書操作（一定要仔細閱讀作業(yè)指導(dǎo)書）看看是幾個樣品及實驗記錄要求。一般實驗室收到的是干粉樣品或者是固體樣品等。假如收到的是干粉樣品，那么第一步就要水化。

樣品水化步驟（建議）：一般能力驗證樣品以國體粉末形式發(fā)放，以液體（CFU/mL）形式出報告。樣品水化前一定要認真、仔細閱讀作業(yè)指導(dǎo)書，看看用多少稀釋液水化，水化后作為原液還是多大濃度的樣品來記錄。

（四）實驗前準備：

a、能力驗證時最好在超潔凈臺或者生物安全柜里操作，這樣就要把超潔凈臺或者生物安全柜提前清理、消毒處理，確保實驗環(huán)境無菌。

b、提前把要用到的平皿、試管、稀釋液等放到操作臺上。

（五）實驗操作：

a、稀釋

將樣品從冰箱中取出達到室溫后開啟使用，在超潔凈臺或者生物安全柜下先用少許稀釋液（選取的生理鹽水）進行水化后吸入無菌瓶或袋中，再用剩余的稀釋液進行洗滌并全部轉(zhuǎn)入無菌瓶或袋中。（具體公需多少稀釋液要看作業(yè)指導(dǎo)書說明）

洗滌轉(zhuǎn)移時注意樣品瓶蓋的清洗和無菌操作，將全部的水化液進行均質(zhì)混勻，一般作為原液立刻進行接種；再取25mL到225mL稀釋液中均質(zhì)混勻，制成10-1梯度樣品勻液。

用1mL無菌吸管取1:10的樣液到9mL生理鹽水試管中，制成1:100的樣液，以此類推。再將幾個稀釋度的樣液接種到提前做好標記的無菌平皿中。

b、傾注平板

將提前在水浴鍋里涼至48℃的平板計數(shù)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15mL，并轉(zhuǎn)動平皿，混合均勻。同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1mL稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內(nèi)作空白對照。傾注過程一般左手拿平皿，右手拿瓊脂瓶，左手將平皿打開30度左右的縫隙，傾注瓊脂大約到平皿底的二分之一處，左三圈、右三圈輕輕混勻，然后放到臺面上。

待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h。

e、觀察計數(shù)

最好，第二天先看看，檢測結(jié)果有沒有異常、是否有蔓延菌落出現(xiàn)。

按照GB 4789.2的要求進行菌落計數(shù)

f、上報數(shù)據(jù)

在對結(jié)果進行分析后，選取檢測結(jié)果的平均值進行網(wǎng)絡(luò)提交。

注意事項：

a.一般能力驗證的樣品添加的菌落濃度都比較高，檢測過程一定要多做幾個稀釋度，每個稀釋度多做幾個平板平行。

b.梯度稀釋：是關(guān)鍵步驟，必須盡可能地減少誤差（新手建議渦旋混勻，渦旋時間不宜過長，長時間離心力等作用下，微生物細胞可能死亡）。

c.傾注用培養(yǎng)基應(yīng)在48℃恒溫裝置內(nèi)保溫，溫度過高會影響細菌生長，過低瓊脂易于凝因而不能與菌液充分混勻。如無沒有恒溫裝置保溫，應(yīng)以皮膚感受較熱而不燙為宜。

d.傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一，從12~20mL不等，一般以15mL較為適宜，平板過厚可影響觀察，太薄又易于干裂。傾注時，培基底部如有沉淀物，應(yīng)將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計數(shù)觀察。

e.傾注過程力度一定掌握好，絕不能把瓊脂濺出來。

f.為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿時要盡可能放在中央部位，然后應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉(zhuǎn)混勻，可正反兩個方向旋轉(zhuǎn)，檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min，以防止細菌有所死亡或繁殖。 

g.瓊脂瓶放水浴鍋前一定要混合均勻，以防出現(xiàn)平皿不凝固現(xiàn)象；拿出傾注時要用噴有75%酒精的抹布擦拭干凈。

h.冷卻的過程不要著急，冷卻充分后再倒置放進培養(yǎng)箱培養(yǎng)，放置的時候要盡量避免放到風(fēng)機口處，每摞不要超過6個平皿。

i.檢驗結(jié)束后所有的稀釋液樣品一定要放到冰箱里0-5℃冷藏，以備必須再用（一旦第二天發(fā)現(xiàn)實驗做錯了，在做一次實驗，死馬當活馬醫(yī)）。